基因治疗是通过将修饰的基因传递至靶细胞中，从而把患者体内的突变基因替换为相对应的健康基因拷贝来实现治疗或者预防疾病的目的。与传统的药物治疗相比，基因治疗是从根本上对疾病进行控制，所以有着非常好的发展前景，在世界范围内得到越来越多医药行业的关注和投入、�/span>

将正常基因（外源）导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法、�/span>

病毒越来越多的用作载体，用于传递基因治疗的遗传物质和疫苗应用。重组腺相关病毒＇�/span>recombinant Adeno-Associated Viruses, rAAV）是基因治疗最为常用的病毒载体之一、�/span>

一、如何开发高效安全的rAAV疗法?

为了开发通过受控和经济的制造工艺生产的高效皃�/span>rAAV疗法，需要解决从病毒衣壳设计到确定最佳工艺和配方条件，再到全面质量控制的多重挑战。应对这些挑战，需要针寸�/span>rAAV样品下列属性进行量身定制的分析表征９�/span>

Ø测定衣壳蛋白或者颗粒滴度（capsidor particle titer（�/span>

Ø完整rAAV颗粒的百分比

Ø穹�/span>-载比＇�/span>Full-empty ratio（�/span>

Ø颗粒的粒徃�/span>

Ø聚集体形成（aggregate formation（�/span>

Ø热稳定性（Thermal stability（�/span>

Ø基因组释放（genome release（�/span>

Ø衣壳电荷＇�/span>capsid charge）等

而所有这些都可能影响最终产品的关键质量属性（CQA）、�/span>

通常＋�/span>rAAV滴度和病毒载量是使用酶联免疫吸附试验＇�/span>ELISA）、定量聚合酶链式反应＇�/span>qPCR）、液滴数字聚合酶链式反应＇�/span>ddPCR）、分析超速离心（AUC）和电子显微镜（EM）的技术组合测定的。这些方法通常既费时又费力，而且其准确性和精确性也值得怀疐�/span>[1]。因此，业内越来越需求一种不依赖于使用专用试剂和昂贵的参考标准品的快速分析解决方案、�/span>

动态光散射(DLS)、多角度动态光散射＇�/span>MADLS）、电泳光散射＇�/span>ELS）、尺寸排阻色谰�/span>-多角度光散射＇�/span>SEC-MALS）、纳米颗粒跟踪技术（NTA）、等温滴定量热法＇�/span>ITC）和差式扫描量热法（DSC）可以提供有关病毒载体的关键分析和质量属性的重要信息，从而能够对多种参数进行表征、比较和优化、�/span>

样品关键参数	马尔文帕纳科的技术方桇�/span>
衣壳蛋白尺寸	DLS�?/span>NTA
衣壳蛋白及转基因 的绝对分子量	SEC-MALS (OMNISEC)
衣壳滴度或颗粒计�?/span>	MADLS, SEC-MALS (OMNISEC), NTA
含基因病毒颗粒百分比分析	SEC-MALS (OMNISEC)
聚集形成分析	DLS, MADLS, SEC-MALS (OMNISEC), NTA
碎片化分枏�/span>	SEC-MALS (OMNISEC)
热稳定性分枏�/span>	DLS, DSC
高级结构分析	DSC
血清型鉴定	DSC
衣壳解聚及基因组注入	DLS, DSC
衣壳蛋白尺寸	ITC
电荷分析	ELS

�?/span>1总结了病毒载体研究中各种重要的关键属性（CQA），以及马尔文帕纳科可以对应提供表征此类信息的各项技术、�/span>

DLS�?/span>MADLS�?/span>SEC-MALS�?/span>NTA�?/span>ITC咋�/span>DSC属于无标记的生物物理技术，需要最少程度的方法开发，并且可以很容易的应用于各个阶段，强化了基因治疗开发的分析工作流程、�/span>

二、高效的表征技术概念解诺�/span>

动态光散射＇�/span>DLS（�/span>

动态光散射(DLS)是一种非侵入式技术，可以测量由颗粒分散体系或分子溶液引起的散射光强度随时间的波动。由于进行布朗运动的颗粒或者分子的随机运动，散射光的强度会随之发生波动。使用自相关算法分析这些强度波动可以确定平移扩散系数，随后根据斯托克�?/span>-爱因斯坦方程确定流体力学尺寸、�/span>

多角度动态光散射＇�/span>MADLS（�/span>

多角度动态光散射＇�/span>MADLS）通过使用三个不同的检测角度（背面、侧面和正面）并将获取的光散射信息组合成一个与角度无关＇�/span>Angular-Independent）的粒径分布，从而可以对多模态的样品进行更高分辨率的尺寸测定。应�?/span>MADLS技术的扩展还可以测量出颗粒浓度＇�/span>Concentration）、�/span>

电泳光散射（ELS（�/span>

电泳光散射（ELS）测定来自在电场中进行电泳的颗粒或者分子的散射光的频移＇�/span>Frequency Shift），并能够计算出Zeta电位。颗粒的Zeta电位是颗粒在特定介质中获得的总电荷，可用于预测分散体系的稳定性并深入了解所研究的颗粒的表面化学、�/span>

尺寸排阻色谱＇�/span>SEC（�/span>

尺寸排阻色谱＇�/span>SEC）是一种分离技术，可根据分子进出柱中多孔凝胶基质的流体力学半径来分离分子。搭配一系列先进的检测器，如光散射（LS）�?/span>UV�?/span>RI和粘度，可以测量绝对分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他参数、�/span>

差式扫描量热法（DSC（�/span>

差式扫描量热法（DSC）是一种直接分析天然蛋白质或其他生物分子热稳定性的技术，无需外在荧光素或者内源荧光，它通过测定在恒定的升温速率下使生物分子发生热变性过程中的热容变化来实现、�/span>

案例研究|综合使用多种技术表�?/span>rAAV性状：衣壳分子量、聚集状态、滴度、稳定�?/span>…�?/span>

1，空rAAV5衣壳分析

SEC-MALS (OMNI-SEC)测量产生的关键数据是绝对分子量，与柱保留时间或用于校准系统的任何标准无关。在穹�/span>rAAV的情况下＇�/span>Fig.1和表2），主要单体皃�/span>Mw丹�/span>3.84 x 10⁶g/mol。空衣壳蛋白的理论分子量丹�/span>3.8 x 10⁶g/mol，证实该分析结果符合预期、�/span>

国�/span>1 rAAV5空壳三重色谱国�/span>

�?/span>2 rAAV5空壳的定量参�?/span>

Mw/Mn描述样品的分散性，接近1的值表示峰中有单个群体，远高于1的值表示峰内有多个群体。在穹�/span>rAAV的情况下，单体和二聚体的Mw/Mn值接运�/span>1，表明是单一群体。聚集体和碎牆�/span>Mw/Mn值显著高亍�/span>1，表明单个峰内具有不同分子量的多个群体（�?/span>2）、�/span>

样品的分数（Fraction of Sample）描述了样本在群体之间的分布情况，在这种情况下，84.7%的样品是单体。蛋白质分数＇�/span>Fraction of Protein）表示样品中衣壳的百分比；在这种情况下，单体�?/span>99.8%的衣壳。这证实样品是空皃�/span>rAAV5。从这种单一分析方法中获得的另一个关键信息是样品滴度；在这种情况下，对于空的rAAV5，测得的滴度丹�/span>5.91x10¹³vp/mL、�/span>

2，完敳�/span>rAAV5衣壳分析

完整rAAV5衣壳皃�/span>SEC-MALS (OMNISEC)分析如图2和表3所示。对于主要的单体峰，计算出的符合Mw丹�/span>4.49 x 10⁶g/mol，其�?/span>86%为衣壳。这样，完整皃�/span>rAAV5的蛋白质组分皃�/span>Mw丹�/span>3.86 x 10⁶g/mol，与�?/span>2中的穹�/span>rAAV5衣壳生成的数据一致。单体部分占毓�/span>93%，样品具有总滴�?/span>7.48 x 10¹³vp/mL、�/span>

国�/span>2完整rAAV5的三重色谱图

�?/span>3完整rAAV5的定量参�?/span>

3＋�/span>rAAV5稳定性研穵�/span>

病毒衣壳的稳定性和功能是一种平衡行为。病毒衣壳必须足够稳定以包含和保护其中的基因组，与宿主细胞表面结合，它们必须提供足够的构象稳定性以在复制位点释放基因货物、�/span>

AAV载体脱壳的机制仍然知之甚少。衣壳脱壳和基因组释放似乎需要结构变化。基于差示扫描荧光法和差示扫描量热法＇�/span>DSC）收集的AAV热稳定性已发表数据＋�/span>AAV热转变的Tm值与衣壳解聚过程有关，可作为AAV血清型的鉴定指标；一种血清型的空AAV衣壳和完敳�/span>AAV衣壳皃�/span>Tm值通常非常相似，并且它们与衣壳动力学、衣壳脱壳和基因组释放没有明显的相关性、�/span>

国�/span>3穹�/span>rAAV5和完敳�/span>rAAV5皃�/span>DSC数据比较，扣除空白和基线皃�/span>DSC数据。垂直方向标记的区域具有明显不同的热转变过程、�/span>

�?/span>4仍�/span>DSC获得的空rAAV5和完敳�/span>rAAV5样品的热稳定性结枛�/span>

文章中记录的完整和空rAAV5样品皃�/span>DSC曲线叠加（图3），根据穹�/span>rAAV5和完敳�/span>rAAV5样品的整佒�/span>DSC图谱差异以及热稳定性参数（妁�/span>Tonset咋�/span>Tm2，表4），可以在图3�?/span>DSC曲线上识别出四个不同的区域，它们可以暂且归因于以下几点：

#1▟�/span>仅在完整皃�/span>rAAV5中出现的区域，从50ℂ�/span>一直延展至75ℂ�/span>，这个过程大�?/span>30分钟。这可能归因于热应激下衣壳蛋白结构和稳定性变化导致的ssDNA的动力学控制下的注射：�/span>

#2▟�/span>在空rAAV5中出现的最明显的预转变过程：�/span>

#3▟�/span>主要转变过程，即协同皃�/span>rAAV5衣壳蛋白发生解组装，这由具有血清型特异性的Tm值所决定：�/span>

#4▟�/span>仅在完整rAAV5中出现的另外的转变过程，很可能归因于ssDNA的解链、�/span>

结论：以上几例是综合应用马尔文帕纳科多种互补技术对基因治疗常用皃�/span>AAV载体一些关键属性的表征，这些无标记生物物理技术需要最少的方法开发，可以从衣壳设计阶段到开发、配方开发和药物原料和产品进行深入表征，加强体内基因治疗开发的分析工作流程、�/span>

详细内容可参文献(Pharmaceutics 2021, 13(4), 586;（�/span>

[1] Burnham, B.; Nass, S.; Kong, E.; Mattingly, M.; Woodcock, D.; Song, A.; Wadsworth, S.; Cheng, S.H.; Scaria, A.; O’Riordan, C.R. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum. Gene Ther. Methods 2015, 26, 228�?42

三、纳米粒度及电位分析仪：DLS/ ELS/ MADLS
马尔文帕纳科Zetasizer Ultra纳米粒度叉�/span>Zeta电位分析�?/span>具有真正的多角度动态光散射技术（MADLS®），提供更高的粒度测量分辨率，及与角度无关的粒度结果，并能够测量颗粒浓度、�/span>

国�/span>4 Zetasizer Ultra纳米粒度叉�/span>Zeta电位分析�?/span>

四�?/span>OMNISEC凝胶渗透色谱仪９�/span>GPC/SEC

马尔文帕纳科OMNISEC凝胶渗透色谱仪是一套完整的凝胶渗逎�/span>/尺寸排阻色谱(GPC)/(SEC)，有前端色谱分离系统、检测器和软件组成，是灵敏准确的多检测器GPC/SEC系统，可以准确测定：

Ø绝对分子量和分子量分市�/span>

Ø特性粘度和分子结构

Ø样品浓度

Ø以及其他多种关键参数

国�/span>5 OMNISEC凝胶渗透色谱仪

五�?/span>PEAQ-DSC微量热差示扫描量热仪９�/span>DSC
马尔文帕纳科MICROCLA PEAQ-DSC微量热差示扫描量热仪能够帮助用户快速确认维持高级结构稳定性的最佳条件，提供简洁、无缝的工作流程和自动化批量数据分析，其所提供的热稳定性信息被业内视为‛�/span>金标凅�/span>“�/span>技术，是一种非标记、全局性的数据、�/span>

国�/span>6 MicroCal PEAQ-DSC微量热差示扫描量热仪

关于马尔文帕纳科

马尔文帕纳科的使命是通过对材料进行化学、物性和结构分析，打造出更胜一筹的客户导向型创新解决方案和服务，从而提高效率和产生可观的经济效益。通过利用包括人工智能和预测分析在内的技术发展，我们能够逐步实现这一目标。这将让各个行业和组织的科学家和工程师可解决一系列难题，如提高生产率、开发更高质量的产品，并缩短产品上市时间、�/span>

联系我们９�/span>

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