介绍

mRNA 疫苗是指将含有编码抗原蛋白的 mRNA 导入人体，直接进行翻译，形成相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性免疫应答，达到预防免疫的作用（�?）、�/p>

mRNA 疫苗的优势主要有９�/strong>

1. 研发周期短、抗原选择范围广，任何可成蛋白的抗原序列均可被选择

2. mRNA 疫苗的半衰期与免疫原性可通过修饰和递送系统来人工调节，由于不进入细胞核，无感染或插入突变的风险，安全性更髗�/p>

3. 多种修饰后的 mRNA 更稳定，在细胞质中被高效摄取和表达；mRNA 疫苗具备自我佐剂特点，因此表现更强的免疫原性，有效性更髗�/p>

4. 可通过体外转录技术快速、廉价地大规模生� RNA 疫苗，在掌了病毒基因序列后即可在 40 天内完成疫苗样品的生产制夆�/p>

方法

该团队首先关注了磷脂和缓冲液� LNP 本身温度敏感性的影响。由� DSPC 的相变温�?Tm)� 55℃，接近喷雾干燥器的出口温度，� DOPE 是一种不饱和磷脂，Tm � -16℃，可改善LNP的温度敏感性，并有研究发现 DOPE 替代 DSPC 可以提高 mRNA 递送效率[1]。LNP 中可电离脂质� pKa=7，因� pH 值的大幅变化可能会导致颗粒结构和稳定性的变化，该团队测试了广泛使用的 PBS � 20 mM Tris 缓冲液的影响。该团队将四种不同的 LNP 配方（DSPC PBS；DSPC Tris；DOPE PBS；DOPE Tris）在不同温度范围孵育以模拟LNP配方和喷雾干燥过程的温度跨度。发� DOPE Tris 组在高达 75� 的温度下仍保持稳定，并且� 80� 时仅损失� 20% � RNA、�/p>

在喷雾干燥的温度条件下更稳定不等于能更好地承受喷雾干燥过程，因此该团队还验证� DOPE Tris LNP 能更好地承受喷雾干燥过程。DOPE Tris 组在喷雾干燥和复� 306Oi10 � MC3 LNP 时均增强了颗粒稳定性� Tris 缓冲液在喷雾干燥方面优于PBS，虽然两种缓冲液� pH 值都会随着温度的升高而降低，� Tris 的变化率� PBS � 10 倍，这意味着Tris缓冲液从 25°C 升至 37°C � pH 将减� 0.3 个单位，� PBS 仅减� 0.025 个单位，pH 值的降低可能会确保RNA仍被封装在LNP中。作者还发现优化的LNP配方(DOPE Tris)显著提高了评估了 LNP 在肝细胞癌细胞系 HepG2 和肺支气管细胞系 16HBE 中的摄取，与 4°C 下储存的液体 LNP 制剂相比，通过喷雾干燥处理并在室温下储存的 LNP 具有更好的稳定性、更高的颗粒封装效率以及更显著的蛋白质表达（�?）、�/p>

(A)使用 DSPC � PBS 生产� LNP 制剂对温度升高敏愞�/p>

(B)� DSPC 替换� DOPE、PBS 替换� Tris 时，喷雾干燥和重新分散后LNP颗粒的稳定性显著提高、�/p>

(C)LNP 制剂在喷雾干�?SD)后稳定性提�?导致 mRNA � HepG2 � 16HBE 细胞具有良好转染效率。比例尺=100μm�?*P<0.01�?**P<0.001�?***P< 0.0001、n.s=不显著、�/p>

该团队发现，当喷雾干� LNP 制剂时，在干燥塔内可观察到均匀的薄膜，在旋风分离器中可观察到薄膜沉积物，这是因为在无赋形剂的情况下，喷雾干� LNP 制剂中每种成分的固化机制将根据其扩散速率和溶解度而有所不同，引起各组分分离。因此该团队优化� LNP、海藻糖、三亮氨酸的比例[2]。发� LNP 与三亮氨酸的比例� 1:4 � 1:5 时，可以减少旋风分离器中的粉末损失，并进一步提高复溶后� mRNA 封装效率，将 LNP 负载� 1.5% 增加� 5%。喷雾干燥后，通过 SEM 分析粉末粒径和表面结构，通过 CryoTEM 分析复溶的颗粒。发现喷雾干燥后复溶� LNP 样品为尺寸范围变化更大的致密小囊泡（�?）、�/p>

(A)粉末配方中三亮氨�?LLL):LNP 比例的优化可将旋风分离器中的损失降至最低，并随着重构� RNA 封装效率 (%EE) 的增加而实现产量最大化、�/p>

(B)喷雾干燥产生 LNP 的扫描电镜照片。当三亮氨酸(LLL)的浓度从 3% 增加� 15% 时，颗粒的形态逐渐从光滑的表面变成高度波纹状的表面、�/p>

(C)新制 LNP 和喷雾干� LNP 代表性冷冻透射电子显微镜图片。与新鲜 LNP 相比，喷雾干� LNP 复溶后被包裹在致密的衬里。比例尺 =200nm�?nbsp;

接下来，该团队验证了 mRNA LNP 粉末制剂在体内的功能性递送。使� Penn-Century Dry Powder Insufflator�?4 装置对动物进行给药，该装置可以将粉末直接输送到大鼠的肺部。肺组织切片上的免疫组化(IHC)显示出强烈的 eGFP 阳性细胞染色。这些细胞根据其定位、形态和免疫荧光标记被鉴定为细支气管上皮细胞、II 型肺细胞�?或巨噬细胞。尽管仅识别出少� eGFP 阳性细胞，但这些阳性细胞的染色强烈、且无背景噪点，表明 eGFP mRNA LNP 在喷雾干燥后吸入给药，可在肺部产生清晰的 eGFP 表达、�/p>

(A)大鼠肺示意图

(B)研究设计的示意图、�/p>

单次给药� 24 小时或连�?天每日给药后 24 小时处死大鼠。给药方式包括气管内(IT)滴注含有 eGFP mRNA LNP 的喷雾干燥制剂或安慰剂、�/p>

(C)在右肺叶的肺匀浆中测量� eGFP 蛋白水平

(D)显示 eGFP 阳性细胞（紫色）的图像

(E)IT 滴注单次(I和III）和 3 天重�?II和IV)给药� 24 小时在大鼠左肺叶中检测到� eGFP(棕色)。eGFP 阳性细胞（紫色）形态学上鉴定为细支气管上皮细胞 (D I) � II 型肺细胞和巨噬细� (D II)。在细支气管上皮细胞(E I)� II 型肺细胞和巨噬细�?E II)中鉴定出 eGFP mRNA (棕色)、�/p>

(F)eGFP 的免疫荧光标记与 II 型肺细胞或巨噬细胞标记物结合，证实两种细胞类型都表达 eGFP、�/p>

(G)左肺叶的组织病理学分析结果、�/p>

左上９�/span>来自对照大鼠的肺组织，显示没有病变、�/p>

左下９�/span>治疗 3 天的大鼠肺组织，显示肺泡实质中的实变区域，代表炎症病变（箭头）、�/p>

中图９�/span>混合炎症细胞浸润区域的较高放大倍数，以较小的气道和描绘肺泡管为中心、�/p>

右图９�/span>代表次级细支气管上皮变化的图像、�/p>

结论

总的来说，该研究团队进行了一项概念验证研究，并成功通过配方优化，设计出亅�strong style="box-sizing: border-box;">用于吸入� mRNA LNP 喷雾干燥制剂。该制剂�?strong style="box-sizing: border-box;">经过喷雾干燥和复溶后仍保持功能，并可在体外和体内有效递� mRNA，能够以临床相关剂量水平实现 LNP 的肺部给�?/span>，在吸入� mRNA 疫苗领域开辟了新道路，具有巨大前景、�/p>

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参考文�?/strong>

1. Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817�?38 (2021).

2. Friis K P, Gracin S, Oag S, et al. Spray dried lipid nanoparticle formulations enable intratracheal delivery of mRNA[J]. Journal of Controlled Release, 2023, 363: 389-401.

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