高效色谱柱筛逈�/strong>

尿嘧啶和黄嘌呤，即咖啡因、可可碱和茶碱，是一组在各种生物过程和人类消费中起重要作用的有机化合物[1-3]。这些分子属于杂环化合物，其特点是含有碳原子和氮原子的环状结构。尿嘧啶� RNA(核糖核酸)的基本组成部分，RNA 是形成遗传密码并参与蛋白质合成的基本核碱基之一。另一方面，黄嘌呤、咖啡因、可可碱和茶碱是一类结构相似但生物效应不同的生物碱[1-3]。这些黄嘌呤存在于各种植物中，是一种众所周知的兴奋剂，可以穿过血脑屏障，影响中枢神经系统。在 RP(反相色谱)[1-3]条件�?SN_802_2023)� LC(液相色谱)可分离生物碱、�/span>

超临界流体色�?SFC)是一种使用超临界二氧化碳(CO2)作为流动相的基本成分的色谱技术。这种状态的二氧化碳被称为超临界，它具有独特的特性，如高扩散系数和低粘度，使其成为分离和分析化合物的绝佳溶剂。与传统色谱方法相比，SFC 提供了许多优势，包括更快的分析时间，更低的溶剂消耗和分离的差异选择性。此外，� RP-LC 相比，SFC 代表了一种正交技术，为各种分析挑战提供了互补的分离能力、�/p>

� SFC 中，色谱柱筛选包括测试不同的固定相，以找到最适合特定分离任务的固定相。固定相是色谱系统的重要组成部分，因为它直接影响色谱的选择性。不同的固定相具有不同的化学功能和与分析物的相互作用，使它们或多或少地选择特定的化合物。通过筛选和选择合适的色谱柱，可以优化分离条件，以获得更好的目标分析物的分辨率和灵敏度、�/p>

本文描述了使� Sepmatix 8x SFC 仪器对尿嘧啶、咖啡因、可可碱和茶碱混合物进行平行柱筛选，随后转移到制备的 Sepiatec SFC-50、�/p>

1设备

• Sepiatec SFC-50 instrument

• Sepmatix 8x SFC instrument

• PrepPure Silica, 5μm, 250 x 10mm

• PrepPure Diol, 5μm, 250 x 10mm

• PrepPure Silica, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure Diol, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure Amino, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure 2-EP, 5μm, 250 x 4.6mm

• Reprosil 4-EP, 5μm, 250 x 4.6mm (Dr. Maisch GmbH)

• PrepPure PEI, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure CBD, 5μm, 250 x 4.6mm

• Cyano, 5μm, 250 x 4.6mm, (Dr. Maisch GmbH)

  
  

2试剂和材斘�/strong>

• 二氧化碳(99.9%)

• 甲醇(�?9%)

• 尿嘧�?99% + %)

• 可可�?99%)

• 咖啡(99%以上)

• 茶碱(99%)

3实验

样品制备９�/strong>

� 50/2.5mL 甲醇/水混合液中，40� 下用超声水浴溶解 0.05g 尿嘧啶，0.07g 咖啡因，0.055g 可可碱，0.085g 茶碱、�/p>

Sepmatix 8x SFC 筛选运行条件：

流动相：A =二氧化碳：甲醆�/p>

流速：3ml /min(每柱)

流动相条件：

0-0.5min�?% B

0.5-8.0min�? - 50%

8.0-9.4min�?0%

9.4-9.5min�?0 - 5%

9.5-10min�?% B

检测：紫外扫描波段�?00nm - 600nm

筛选运行是自动开始的。使用流量控制单元将流量设置为每通道 3mL/min，并平衡色谱柱。自动进�?V=5 μL)，开始平行筛�?运行时间=10min)。背压调节器设置� 150bar，柱箱加热至 32°C、�/p>

SFC-50 运行条件９�/strong>

流动相：A =二氧化碳；B=甲醇

流动相条件：等度运行条件

检测：紫外波长 270nm

SFC 柱在规定的流速下条件预热 3 分钟，使用定量环自动注入样品并开始运行。背压调节器设置� 150bar，柱箱加热至 40°C、�/p>

3结果与讨讹�/strong>

� Sepmatix 8x SFC 筛选色谱柱９�/strong>

为了确定样品的最佳分离选择性，进行了不同色谱柱的筛选。使� Sepmatix 8x SFC 仪器可以高效地同时筛�?个色谱柱。因此，最佳选择性可以在很短的时间内确定。为此，使用� 8 种不同的固定盷�硅胶、二醇基、氨基、氰基�?-EP�?-EP、PEI � CBD，图1显示了筛选的结果、�/p>

▲图1：Sepmatix 8x SFC 仪器筛选结果。从左到右依次为:硅胶、氨基、氰基、二醇基；下从左至右依次为：2-EP�?-EP、PEI、CBD 柱；运行时间=10分钟

用分辨率(R)来衡量色谱方法在色谱图中分离和区分两个相邻峰的能力，它量化了分析物相互分离的程度。表 1 显示� 4 组分分离的分辨率值。使� Sepmatix 软件和以下公式自动确定：

• 其中tR1 � tR2 代表 组分 1 或组� 2 的保留时闳�/p>

• W1 和W2 代表分量1或分� 2 峰高一半处的宽�?/p>

在处理复杂的混合物时，分辨率尤其重要，因为它确保每个分析物都被很好地分离，并且可以准确地识别和定量。分辨率� 1 表示峰值根本没有被分解，基本上是合并的，而更高的分辨率值表示峰值之间的分离更好。在使用过程中，分辨率至少应达到 1.5，才能以适当的定量和鉴定分析物、�/p>

�?：SFC 不同筛选条件下的分辨率倻�/p>

R 值的筛选和评价表明，硅胶、二醇基� PEI 相对样品的分离选择性最好。二醇基在运行时间和分辨率方面表现出最佳性能。硅胶柱上的分离并不完全是茶碱和咖啡因的基线分离。PEI 相的运行时间相对较长，因为样品分子的位阻较大。表 2 为洗脱顺序，这是通过测定的光谱和组分的单独进样来确定的。与其他相相比，硅胶显示出不同的洗脱顺序。对于氰基�?-EP � 4-EP，不能完全确定洗脱顺序、�/p>

�?：SFC 不同色谱柱筛选条件下的洗脱顺庎�/p>

将开发方法通过 SFC-50 放大９�/strong>

由于二醇基取得了最好的结果，因此选择� 5μm, 250 x 10mm � PrepPure 二醇基进� Sepiatec SFC-50 方法放大制备。由于通过堆叠注射法纯化混合物的效率明显高于多次梯度注射法，该方法是在等度运行条件下实施的，这是使用堆叠进样的要求。在等度条件下，样品只能在低甲醇含量下分�?见图2，下)。在高甲醇浓度下，由于流动相的高洗脱强度，尿嘧啶、咖啡因、茶碱和茶碱是不可分离的(见图2，上)、�/p>

▲图2：使� PrepPure Diol 5 μm, 250 x 10mm 色谱柱分离样品。上:流逞� 20 mL/min, 150 bar, 40℃，270nm, 33% B，进样量= 0.09 mL，运行时闳� 4 min；下:流量= 20 mL/min 150 bar 40°C, 270 nm, 12%甲醇�?.09 mL，运行时闳� 5 min

改变压力和温度可以优化分辨率。最佳分离条件为 40� � 150bar、�/p>

� 3 为图 2(�?实验条件下的堆叠进样情况，堆叠时间为 2.42min，因此每 2.42min 进样一次。在这种情况下，由于每次额外注入节省了平衡时间，因此提高了产能、�/p>

为了更有效的多次分离，可以使用硅胶填料。使� 34% 的甲醇作为改性剂，将堆叠时间缩短� 2.15min。与二醇基相比，硅胶填料� 100bar 下表现出更好的性能。然而，� 1.5 的分辨率下，咖啡因和茶碱并不能获得理想的基线分离。由于硅胶的极性比二元醇高，为了快速洗脱，必须增加改性剂的含量，但这也导致溶剂消耗增加、�/p>

4结论

在本文中，使� Sepmatix 8x SFC 进行柱筛选，并将开发结果转移到 Sepiatec SFC-50 进行放大。在色谱参数分辨率和运行时间方面，二醇基表现出最好的效果。对于二醇基，根据筛选结果，� Sepiatec SFC-50 仪器上采� 250 × 10 mm 柱进行等度堆叠进样。作为比较，开发了另一种用于硅胶填料的方法，但分辨率值略差、�/p>

这种分离表明，要想在 prep-SFC 中获得一个好的分离方法，事先通过柱筛选确定最佳选择性是很重要的。然后，该方法可以在 prep-SFC 上简单实现，并进行了优化。最理想的是，该方法在等度条件下应用，以最大限度地提高产量、�/p>

每次注射后的叠加紫外信号表明该方法具有良好的再现�?�?�?，下�?。垂直线描述了收集相应分数的时间窗口、�/p>

▲图3：堆叠进样与二醇柱分离。流逞� 20 mL/min, 150 bar, 40℃，270 nm, 12% B，进样量= 0.12 mL；堆叠时闳�2.42 min，注射次数：8次；上图：最终色谱图；下图为各注射剂的紫外信号叠加图

▲图4：堆叠进样与硅胶柱分离。流逞� 16 mL/min, 100 bar, 40℃，270 nm, 34% B，进样量= 0.09 mL；堆叠时闳�2.15 min，注射次数：7次；上图：最终色谱图；下图：分别�?54 nm�?70 nm处注射的叠加紫外信号

5参考文�?/strong>

DOI: 10.1021/jf030817m

DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.11.013

DOI: 10.1016/j.saa.2004.03.030

Laboratory Chromatography Gμide, ISBN 3-033-00339-7, by Büchi Labortechnik AG (Switzerland)