喷雾干燥 & 冷冻干燥技�?/span>

制备白细胞介素粉体研穵�/span>

趋化因子是一种小�?8-12 kDa)细胞因子，参与许多病理过程，因此是重要的靶点。它们通常由不同类型的细胞(如白细胞)分泌，并通过与同� G 蛋白偶联受体的细胞表面结合来介导生物学效应。趋化因子配体和受体� 50 多种，根据其初级氨基酸序列的半胱氨酸残基排列进行分类和命名、�/p>

趋化因子可用�?慢�?炎症性疾病、癌症和感染性疾病的治疗应用。目前，市场上有两种基于白介素的产品，即重组白介�?11预白介素(Neumega®)和重组人白细胞介�?2醛白介素(Proleukin®)。Neumega® 是一种由大肠杆菌重组 DNA 技术产生的血小板生成生长因子，可静脉给药。皮下应用的 Proleukin® 是一种淋巴因子，也是通过转基因大肠杆菌的重组 DNA 技术产生的。为了增加储存的稳定性、保持药物的生物活性，Neumega® � Proleukin® 都采用冷冻干燥的工艺，制成冻干粉制剂使用、�/p>

虽然冷冻干燥（FD）是一种广泛使用的技术，具有多种优点，可以快速、温和干燥，但喷雾干�?SD)可以缩短工艺周期，并可以在常压下进行加热处理。同时，颗粒的性质，如粒径、固体状态和残余水含量可以通过参数进行调节。这里必须指出的是，蛋白质的变性或/和展开也可能发生在 SD 过程中，SD 过程的放大是复杂和高成本的。SD 的另一个重要挑战是粉体回收率低� 100%，这对于高成本疗法和工艺开发来说是一个问题，特别是放大到最终设备上、�/p>

对于白细胞介素，已经有了一些成功的冷冻干燥研究案例。然而，据我们所知，SD 作为一种替代方法尚未被研究过。这项工作的目的是开发一� SD 工艺，使模型白介素以一种保留白介素结合亲和力和生物活性的方式干燥。为此，我们使用了模型白细胞介素，探索喷雾干燥工艺的潜在可行性，并对比分析冷冻干燥和喷雾干燥工艺对白细胞介素活性影响、�/p>

1材料

• 在磷酸盐缓冲盐水中提供野生型CXCL8（CXCL8�?2个氨基酸�?.4kDa）、CXCL8的突变体（dnCXCL8�?6个氨基酸�?.7kDa）等各种试剂、�/p>

• 将蛋白质溶液用PBS稀释至最终蛋白质浓度�?mg/ml，即1% w/w、�/p>

• 冷冻干燥朹�/p>

• 喷雾干燥仪：BUCHI B-90 HP

▱�/span> BUCHI B-90 HP

2实验过程

配方溶液分别采用如下冻干程序（表1（�/span>和喷干程庎�span style="color: rgb(146, 208, 80);">（表2（�/span>进行样品制备。干燥后的样品在 4-8� 的氩气干燥器中保� 12 周。并进行粉体的物性表征、�/p>

�?，适用于所有配方中 FD 程序。箭头表示间隔内的压力或温度增减、�/p>

�?，SD 工艺参数及由此产生的过程变量。通过使用纯缓冲液进行测量来确定以 ml/min 为单位的喷射速率。实验过程中喷嘴温度升高，喷嘴温度是� SD 过程结束时观察到的温� 、�/p>

3实验结果

1� 通过激光衍射分析测定粒徃�/span>

SD 蛋白粉通过 HELOS 系统的激光衍射分析进行筛选。在 SD 后和�?周、第8周和�?2周将粉末直接湿分散在甲苯中进行分析。通过对同一批次 SD 粉的三个样品进行测量，确定了 PSD 分析的标准误差。不分析 FD 粉末的粒度，因为冻干物通常是最终的药物剂型，没有对饼状进行研磨或破碎，只分析了 SD 粉、�/p>

�?通过激光衍射分析测定粉体粒径，� 10 次超声脉冲后进行测量，SD 粉末� PSD 随储存时间的变化不大。除了在�?周分析的 SD dnCXCL8 喷雾粉末和在�?周分析的 SD HSA-dnCXCL8 外，所有干粉的跨度都小� 2.8。在测量这两� PSD 时，一些较大的团块将分布分别向 517μm � 129μm � x90 方向移动(�?b、图1c)，导� PSD 变宽、�/p>

2� 圆二色光谱测定结枃�/span>

利用圆二色谱(CD)� SD � FD 后的蛋白质二级结构的变化进行评价，并将其与未处理蛋白质的光谱进行比较。CD 光谱在设备上记录，波长为 190-250nm，使� 1mm 石英比色皿，响应时间 4s�? 次扫描取平均值，并用 PBS 校正背景，计算平均残基椭圆率，并绘制不同曲线、�/p>

田�span style="color: rgb(146, 208, 80);"> �?显示，经� SD � FD 后的 CD 光谱显示只有轻微的结构变化。液体白细胞介素制剂� 90� 温度下热处理5分钟，SD 温度� 60� 温度下热处理 5 分钟，会产生轻微的沉淀，但结构保持完整(�?A)。dnCXCL8 也出现类似的结果。SD � FD 均未引起二级结构的改变。即使加热蛋白质也未引起二级结构的变�?�?B)。虽� HSA-dnCXCL8 具有更明确的α-螺旋结构，但 SD � FD 后没有变化。在 90� 热处� 5min 后二级结构发生了完全损失(�?C)、�/p>

3� 离液展开测定稳定�?/span>

采用荧光光谱检测gdmhcl�?-6M范围内诱导展开，并在SD和FD后和储存3个月后测定蛋白质稳定性。将样品稀释至0.7μM，并在室温下平衡5min。CXCL8 和dnCXCL8 的激发波长为 280nm, HSA-dnCXCL8 的激发波长为 290nm。在 300-400nm 范围内测量所�?种蛋白的发射光谱，并将狭缝宽度设置为 5nm。蛋白质展开的特征是波长移位，并使用 Origin 2019b 的玻尔兹曼进行计算得到如下图谱、�/p>

�?显示，展开的过渡中点和 CXCL8 的相对协同性在很大程度上没有变化。对� dnCXCL8，无法建立明确的过渡点。对� FD HSA-dnCXCL8 也观察到了同样的情况。对于参考光谱和 FD 光谱（HSA-dnCXCL8 除外），显示了标准偏差，如图中的误差条所示、�/p>

4� 趋化性测试：博伊登室测定

为了检� SD � FD 后以及储存三个月后的白细胞介素的活性，进行了趋化试验测定中性粒细胞的活化和迁移，预� CXCL8 具有促迁移作用，� dnCXCL8 和HSA-dnCXCL8 不应表现出任何中性粒细胞迁移激活。使� NIS-Elements BR 3.2 软件进行细胞计数，计算每种情况下的平均值和标准偏差、�/p>

上图显示储存 12 周后 SD CXCL8 � CI 较对照显著增� (�?a, p = 0.05)。SD � FD CXCL8 在中性粒细胞活化和迁移方面没有变化。对� dnCXCL8, SD � FD 样本� CI 与各自的参� CI 相当。HSA-dnCXCL8 � SD � (即W0) � CI 显著增加 (�?c, p = 0.04)、�/p>

4结论

本研究针对磷酸盐缓冲盐水配制的白细胞介素（未添加额外添加剂）采用 SD � FD 两种干燥方式分别进行深入评估。用纯缓冲液进行� DoE 确定了一种最佳的 SD 工艺，在 60� 的干燥空气温度�?00 L/min 的空气流速和 30% 的喷雾速率下具有较高产率，这表明即使是热不稳定的蛋白质也可以喷雾干燥。此外，SD 工艺� FD 更快、更有效，理论上导致每分钟产量比 FD � 130 倍（甚至考虑� SD 的产量仅 63% � 77% 之间）。FD 粉末呈现饼状结构，� SD 粉末的粒度为 X50<20μm。这为粒子工程提供了定义粒子特性的可能性，允许更广泛的应用。RM 是可比较的，同样二级结构没有改变，结合亲和力和活性保持至� 12 周，这些结果表明白细胞介素的 SD 是可行的。未来，将继续优化本研究中的工艺参数，并将其转移到具有工业型台式喷雾干燥器中，以更大规模地系统考察粉体产量和工艺时间，从而对 SD 进行全面评估，作� FD 的替代方案，实现经济快捷高效的生产！

5文献来源

Comparing freeze drying and spray drying of interleukins using model protein CXCL8 and its variants