农业部指定非洲猪瘟试剂盒

核酸DNA提取试剂盒（柱膜法）使用说明�?/p>

【产品名称【�/p>

通用名称：病毒DNA提取试剂监�/p>

英文名称：Extraction Kit for Virus DNA

【预期用途【�/p>

本试剂盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血、血淸、拭子、组织、饲料及环境中的病毒DNA的提取，纯化的核酸可适用于各种常规操作及PCR试验、�/p>

【试剂盒组分【�/p>

I、试剂盒组成及贮藏条仵�/p>

名称	20T	50 T
1、吸附柱	20�?/span>	50�?/span>
2、收集管	20�?/span>	50�?/span>
3、裂解液	5mL	11 mL
4、洗液I	13mL	32 mL
5，洗液II	13mL	32 mL
6.洗脱涱�/span>	1.2 mL	3 mL

　　2� 保存条件及有效期：室温下保存，有效期12个月.

　　3� 需自备材料：无水乙醇�?.5 mL无菌离心管�?.5 mL无菌离心�?长臂�?、生理盐水、研钵、无菋�/p>

　　1mL� 2OOuL�?0uL枪头、记号笔等、�/p>

　　【操作步骤【�/p>

　　一、样品制夆�/p>

　　1� 血液样品：抗凝血样品置离心管中，8000�?分钟离心2分钟，取上层血浅�非抗凝血样品置离� 管中，待凝固后，8000�?分钟离心2分钟，取上层血清，置于灭菌离心管中，编号待检、�/p>

　　2� 组织样品：采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体等病变组织样�?.1 g.组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加�? mL生理盐水混匀�?000�?分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心骨屮，编号待检、�/p>

　　3� 口腔液：进食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉线绑纱布团吸引动物咀嚼，收集口腔液大� 500uL� 8000�?分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检、�/p>

　　4� 饲料：取适量研磨后的饲料(�?.2g)，放入含1 mL生理盐水或PBS(PH�?.4)缓冲液的2 mL EP 管屮，振荡混匀�?000�?分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检.

　　5� 灰尘：用无菌棉签蘸取适量环境表面上的灰尘，放入含1 mL生理盐水或PBS(PH�?.4)缓冲液的2 mL EP管中，振荡混匀�?000�?分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检、�/p>

　　二、DNA的提叕�/p>

　　1、取裂解�?00uL加入无核酸酶1.5 mL离心曾屮，分别加入血�?血�?组织液等样品�?00uL. 震荡混匀10秒或颠倒混匀10次，室温放置5分钟(如果室内温度较低�?需放置25C水浴温育)，再加入200uL无水乙醇，颠倒混匀10科�若样品浑浊则�?2000�?分钟离心1分钟处理，取上清液，以避免堵塞柱孏�

　　2� 将液体转入套有收集管的吸附柱中， 12000rpm离心1分钟９�/p>

　　3� 弃收集管液体，向吸附柱中�?00uL洗液I � 12000 rpm离心1分钟;

　　4� 弃收集管液体，向吸附柱中�?00uL洗液II� 12000 rpm离心I分钟;

　　5� 弃收集管液体�?2000 rpm离心2分钟，以彻底去除残留洗液;

　　6、将吸附柱转入新的无核酸�?.5mLEP�?长臀�?中，向柱中央滴加50 uL洗脱液，静置1分钟� 12000 rpm离心1分钟，EP管中液体即为病毒DNA、�/p>

　　【注意事项【�/p>

　　1� 实验前诺仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行.在操作过程中对时间、试剂体积等 粘确控制可以获得**的结果、�/p>

　　2� 样本应新鲜采集使用，或低温运输储字�

　　3� 样本具有潜在感染风险，核酸的提取应在核酸提取实验室的生物安全柜中进行、�/p>

　　4� 核酸提取冇关耗材确保高温灭菌，提取后核酸尽快进入下一步试验或冷冻保存待用、�/p>

　　5� 试剂使用前应混合均匀，试剂具有一定腐蚀性，使用时请戴手套、口罩做好防护、�/p>

　　6. 低温下裂解液出现结晶数属正常现象，可�?0��C水浴加热助溶后使用、�/p>

　　7� 实验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理、�/p>

　　仅供兽医诊断使用

非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒说明�?/p>

【兽药名称【�/p>

通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒

汉语拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名称：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名称：无

【主要成分与含量】试剂盒中含有如下组刅�

试剂盒组刅�/span>	含量
阳性对�?/span>	250��L/�?#215;1箠�/span>
阴性对�?/span>	250��L/�?#215;1箠�/span>
PCR反应涱�/span>	850��L/�?#215;1箠�/span>
萌混合液	150��L/�?#215;1箠�/span>
说明�?/span>	1�?监�/span>
【作用与用途� 本试剂盒可用于血液、脾脏、肝脏、淋巴结� 样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测、�/span> 扁桃体、肾脏、肌肉、环境样品等

　　【用法与判定【�/p>

　　1 用法

　　1.1待检样品釆集、保存及运输

　　1.1.1样品釆集

　　(1) 活猪样品 无菌采集抗凝血或血�?mL

　　(2) 病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品 无菌采集死猪的牌、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌 肉等组织样品�??8��C低温运至实验室用于检测、�/p>

　　(3) 病猪污染的周边环� 采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品�??8��C低温运至实验室用于检测、�/p>

　　1.1.2样品保存 采集的样品在2?8��C保存应不超过24小时�?70��C条件下保存，避免反复� 融、�/p>

　　1.1.3样品运输泡沫箱加冰袋后密封进行运输。包装和运输应符合农业农村部《高致病性动 物病原微生物�?�?种或者样品运输包装规范》和交通运输部门关于危险品运输管理的有关规定、�/p>

　　1.2样品处理

　　1.2.1血液样品处� 抗凝血样品置于离心管中�?000 r/min离心2分钟取上层血浆，编号� 检。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，8000 r/min离心2分钟�?00��L上层血清，编号待检、�/p>

　　1.2.2组织样品处理取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肌肉等组织，置于研磨器或研� 管中研磨，再加适量生理盐水混匀，制成约10%的组织匀浆，8000 r/min离心2分钟，取200��L� 清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用、�/p>

　　1.2.3环境样品处理

　　1.2.3.1粪便、饲料样品处理方法取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中研磨 混匀，制成约10%的匀浆液.8000 r/min离心2分钟，取200��L上清于RNase/DNase-free无菌离心 管中，编号备用、�/p>

　　1.2.3.2污水样品处理方法 直接�?00��L污水进行核酸提取、�/p>

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法进行DNA核酸提取、�/p>

　　1.4荧光PCR反应９�/p>

　　1.4.1从试剂盒中取出荧光PCR反应液、酶混合液，室温融化后，2000 r/min离心5秒。设� 检样品、阳性对照和阴性对照总和为n，则反应体系配制如下９�/p>

　　试剂 体系

　　PCR 反应� 17�� (n+1) ��L

　　酶混合液 3�� (n+1) ��L

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按�?0��L/ 管分装量将试剂分装至荧光PCR反应管、�/p>

　　1.4.3在上述制备好的荧光PCR反应管中分别加入阴性对照、阳性对照各5��L、处理好的待� 核酸�?��L，终体积25��L/管，盖好荧光PCR反应管盖，混匀后瞬时离心，转移到荧光PCR仪器 上、�/p>

　　144将PCR反应管放置在荧光PCR仪样品槽中，在荧光PCR仪上运行以下程序９�/p>

步骤	条件	循环�?/span>
UNG处理	50ℂ�/span>�2分钟	1
预变�?/span>	95ℂ�/span>�3分钟	1
预扩墝�/span>	95 ℃： 8 � 55 ℃： 8 科�/span>	5
PCR扩増	95 ℃： 8 � 55 ℃： 8 科�/span>	40

　　荧光通道选择FAM，在PCR扩增阶段每个循环�?5C时采集荧光信号。设置扩增体系为25卩I� 同时要选择passive reference和quencher为none的模式�?注：若荧光PCR�?如AB17500)按说� 书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行，可将预扩增和PCR扩增条件变更�?5C� 5� 55��C� 30 �?

　　2结果判定

　　2.1试验有效性判宙�/p>

　　阳性对照有典型扩增曲线且Ct值≤30.且阴性对照无Cl值或无扩增曲线，线形为直线或轻微 斜线，无指数增长期。则判试验结果有效。否则，此次试验视为无效、�/p>

　　2.2样品判定

　　2.2.1阳性：样本检测结果Ct值≤35且有明显指数增长期，判定检出非洲猪瘟病毒核酸、�/p>

　　2.2.2可疑：样本检测结果Ct值在35?38范围内。此时应对样本进行重复检测，如果重复实验 结果Ct值仍�?5?38范围内，有明显指数增长期.则判定为阳性，否则为阴性、�/p>

　　2.2.3阴性：样本检测结果Ct倻�38或无Ct值，判定未检出非洲猪瘟病毒核酸、�/p>

　　【注意事项�?1)实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作� 程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得**的结果、�/p>

　　(2) 实验室应严格按照有关规定分区管理，依照配液区-模板提取�?扩增�?分析区顺� 进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求、�/p>

　　(3) 核酸提取有关耗村确保洁净、无DNase/RNase，提取过程尽量低温、快速，完成后进� 下一步实验或冻保、�/p>

　　(4) 对于顶部采光仪器要带新的一次性PE手套对荧光PCR管封盖，对于底部采光�?/p>

　　器要避免徒手或使用过的手套接触荧光PCR管底，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套、�/p>

　　(5) 冻存试剂使用前应于室温下完全融化，瞬时离心使液体完全沉于管底。避免反复冻融， 以免影响试剂性能、�/p>

　　(6) 样品、阳性对照等在使用后及时封盖�?避免组分间及气溶胶等的污染造成假阳性、�/p>

　　(7) 扩增产物禁止开盖，实验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理、�/p>

　　【规格�?0头份/监�/p>

　　【贮藏与有效期】试剂盒�?20��C以下避光保存，有效期12个月、�/p>

　　【批准文号】兽药生�?63668871

　　【生产企业】郑州中道生物技术有限公号�/p>

　　仅供兽医诊断使用