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IZON qEV 尺寸排阻柱，快?可靠地纯化细胞外囊泡
操作流程 3
安全预防
? 当使 qEV 柱时采取适当的个人防护措施，比如实验服，手套和防护镜、/span>
? 柱子的抗菌溶液包 0.05% w/v 的叠氮化钠。大量的叠氮化钠有毒，所以应该避兌/span>皮肤和眼睛的直接接触、/span>
? 废弃缓冲液应妥善处理。叠氮化钠会在铜制管道中累积引起爆炸、/span>
? 生物样品可能有危险，当使 qEV 柱时＋/span>请教实验室安全员有关样品安全操作的要点、/span>
保存
柱子保存在含有抑菌剂（例 20 %乙醇，或<0.05 % w/v 的叠氮化钠）的溶液中，存放于+4?8 C。抑菌剂可以在冲洗步骤时引入（见囉/span>泡收集后部分）、/span>
使用剌/span>
如下图所示：
? 将柱子固定，使液面水平（确保柱子垁/span>直）
? 不要移除底部滑动盕/span>
? 小心缓慢地移去顶盕/span>
柱子的平衠/span>
? 移除底部滑动盖，并且使用至少 10 mL 洖/span>脱缓冲液（PBS）冲洗柱子。如果不是使?/span>PBS 洗脱，那么至少使 30 mL 洗脱缓冲涱/span>冲洗柱子。记 5 ml 缓冲液通过尺寸排阻柱通过的时间，这可用于判断何时需要清洗柱子、/span>
? 确认有充分的平衡时间使柱子温度介于操作温度范围内、/span>
? 不要使柱子变干。顶部的筛板必须保持湾/span>润。柱子变干会影响其功能、/span>
? 使用当天新配的过滤（0.2 m）缓冲液避免引入颗粒物污染、/span>
? 为了**的结果，建议购买 Izon Prep andReagent 试剂盒、/span>
? 如果在操作温度范围之外使用，可能会得到错误的结果、/span>
样品的纯匕/span>
一.样品的引入的应用
1. 在柱子移除底部滑动盖之前，用移液枪移陣/span>筛板顶部的缓冲液、/span>
2. 加入 500 L 样品、/span>
3. 立即移去底部滑动盖、/span>
4. 立即开始收 0.5 mL 馏分：/span>
? *开始的六个馏分?.0 mL）是空隙佒/span>积，不包含囊泡，通常无需分析、/span>
? 建议将空隙体积收集在同一个收集管?/span>来节约时间，并可避免 6 个单独的管子带来的测量误差、/span>
5. ?后的样品刚刚进入柱子顶部筛板（与乊/span>相平），加入更多的缓冲液，但是不要高于顶部筛 2 mL、/span>
? 等待直到*后一滴样品刚刚进入柱子顶部筛板，避免样品稀释、/span>
? 样品馏分收集
当依据操作流程使 qEV 柱时，EVs 大多数洗脱于馏分 7? 9 中，去除了～99.8 %的蛋白；
大于 10 的馏分包含更多的蛋白和更少的囉/span>泡，不建议分析。为了得到更高的 EV 回收率，馏分可以合并起来，但是，合并馏分会稀 EVs 的浓度、/span>
方法 A 得到**的纯度和浓度
不同的样品会得到不同的洗脱峰形，因此建议预先测量 EV 浓度并对所有馏分（7 - 11）进衋/span>蛋白纯化、/span>
1. 空隙体积之后立即收集 3 个囊泡馏分，毎/span>个馏 500 L（馏 7? 9）、/span>
2. 测量每个馏分 EV 浓度（使 IzonqNano）和蛋白纯度、/span>
? 为了得到高浓度囊泡，使用** EV 浒/span>度的馏分（通常 7 8）。注意：合并馏分会稀 EV 浓度、/span>
? 为了得到高纯度囊泡，使用*低蛋白浓度的馏分、/span>
方法 B 一般使用操佛/span>
空隙体积之后立即收集一个囊泡馏分，1500L。为了减少蛋白污染，建议只收 1000 L、/span>
? 囊泡收集名/span>
当收集完囊泡馏分之后，用至少 10 mL 缓冲涱/span>冲洗柱子，并按照《保存》部分的要求保存柰/span>子。记 5 ml 缓冲液通过尺寸流过尺寸排阻柰/span>所需要的时间，这对于检测何时清洗柱子很月/span>用。流速的改变可能暗示柱子被堵住或被污染、/span>
qEV 柱的维护
再次使用
如何检测柱子何时被污染并需要清洁；
? 流速相比初始流速开始变缓。因此建议测量初始冲洗流速（和／或空隙体积）作为对比、/span>
? 如果较先前相似的样品来说回收率明显下降，那么期望 EVs 产率也相应下降。如果是这样，使 Izon CPC100 校正颗粒（稀释于 PBS 缓冲溶液中），收集馏分并使用qNano 测量至少 2000 个数。两个峰值馏刅/span>的回收率应该>50%、/span>
? 在冲洗完后，柱子顶端有颜色的变化、/span>
注意
? 对于新的柱子和干净或再生的柱子，顶盕/span>和凝胶表面之间的空间说明储存过程当中凝胶有所沉降，并不影响其性能。为了使
样品的稀释影?小化，可以将顶盖向下推动<2 mm、/span>
? 当囊泡馏分随后被用于 PCR RT-PCR 时，建议柱子单次使用、/span>
柱子的再甞/span>
通常使用 20 30 mL 缓冲液清洗柱子，随后佾/span>用新缓冲液平衡柱子（如果更换环境）、/span>在一些应用中，变性的蛋白或脂质不会在再生步骤中被洗脱下来。可以通过下面的清洗步骣/span>来去除、/span>
柱子的清洖/span>
去除沉淀蛋白、非特异性吸附蛋白和脂蛋發/span> 10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子，然后用至少 30 50 mL 缓冲液冲洗柱子，并检查洗脱溶涱/span>pH、/span>
去除强非特异性吸附蛋白、脂蛋白和脂?/span>
20 mL 非离子型表面活性剂溶液，如 0.1 %Triton X-100 清洗柱子，然后用至少 20 30mL 缓冲液冲洗柱子、/span>
在某些情况下，一些样品仍会残留痕量蛋白、/span>在清洗结束时再次检查蛋白含量，如果蛋白氳/span>平高于预期，再清洗一次、/span>
柱子的消毑/span>
消毒可以**程度减少凝胶的微生物污染。用10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子。然后用 30 50mL 无菌缓冲液平衡柱子，并检查洗脱溶涱/span>pH、/span>
注意
? 脱气缓冲液有助于避免凝胶基质中气泡的产生。少量的气泡＇10）对柱效影响?/span>小、/span>
? 建议使用 0.15 M 或更高离子强度的缓冲液，以避免溶质与凝胶基质之间产生不必要的离子相互作用、/span>
? 为了避免尺寸排阻柱的堵塞，建议过滤或低速离心生物样品以去除大颗粒物、/span>
柱子的性能指标
囊泡的峰值洗脰/span>
? 对于 500 L 的样品体积，囊泡的洗脱峰倻/span> 4.0 mL 0.5 mL、/span>
? 两个峰值馏分的回收率大 50 %、/span>
? 对于 500 L 的样品，峰值馏分通常在馏 8 9 之中。如果希望更高的纯度，可以只收集*早的峰值馏分、/span>
通过测定 280 nm 处的紫外吸收可以得到 qEV柱的蛋白洗脱图。通过 Bradford 法可以准确测定每个馏分中蛋白的精确含量。图 1 展示了当500 L 血浆样品上样至柱上时的囊泡洗脱图、/span>每个馏分的囊泡浓度通过 qNano 测量，蛋白含量通过 280 nm 处的吸收值来测量、/span>
囊泡的富集是十分明显，它们主要存在于馏分7? 9 中。血清蛋白的洗脱更慢一些，主要存在于馏 11 - 30 中。大 10 的馏分通常?/span>有高浓度的蛋白和低浓度的囊泡，不建议用来做分析、/span>
EVs 的洗脱始于馏 7，馏 8 9 的浓度达?/span>**。收集越多的馏分，EVs 的总回收率趉/span>高、/span>
2 血浆中 EVs 的回收率说明了这点。但是，收集的馏分越多，EV 的回收浓度就会越稀释、/span>见表 1、/span>
上样体积
上样体积越大，囊泡馏分中的囊泡纯度越低、/span> 3 展示了血清上样体积为 100 L?00 L 咋/span>2000 L 时的囊泡分布?000 L 的样品导致囊?*程度地被蛋白污染?000 L 样品中外泋/span>体的出峰延迟显而易见、/span>
为了得到更纯 qEV，建?*的样品体积为100 L 500 L，这样囊泡会洗脱于馏 7 臲/span>9 之中、/span>
4 展示了血清上样体积为 100 L 500 L 旵/span>的囊泡洗脱图、/span>
囊泡的损失发生在当样品体积大 500 L 时，囊泡的洗脱峰很宽以至于一些囊泡从馏分 11中被洗脱下来。这些馏分不建议用来分析因为包含了大量的干扰蛋白、/span>
纯化
5 展示了馏 7 9 之间含有很少量的蛊/span>白，且越后面的馏分中蛋白含量越多、/span>
6 展示了经 qEV 柱纯化后，EVs 相对于蛋白的纯化度。每个馏分的纯化因子（纯化前名/span>蛋白的减少比例）如图所示。馏 7 8 富集 EVs *多，也就是相对于回收的囊泡来说大部分蛋白被除去、/span>
qEV 柱纯化过程中的稀釉/span>
为研 qEV 纯化过程中对样本的稀释，用已?/span>浓度的聚苯乙烯纳米颗粒标准品和脂质体来模 EVs 的尺寸和组成、/span>
稀释因子取决于哪些馏分被合并起来。起始体积为 500 L 的聚苯乙烯纳米颗粒标准品（直徃/span>众数 400 nm）的总回收率为～100%、/span>
7 说明合并馏分 5 11 可以得到 100%的颗粒回收率。这导致稀释因子为 7，并且收集的馏分含有大量的干扰蛋白，因此不适于实际库/span>用、/span>
1 展示了收集不同馏分的稀释因子以及回收率、/span>
虽然可以获得 100％的回收率，但是也可以這/span>过测量每一个馏分的颗粒浓度，将浓度**皃/span>两个馏分合并起来。因此回收率与纯度之间存在折衷。当将馏 7 8 合并起来时，脂质佒/span>实验的回收率为～50 %，与聚苯乙烯纳米颗粒的结果相一致、/span>
依据 EVs ?终浓度，可以不稀释馏分，直接 qNano 来测量每 的浓度。对亍/span>qNano，每分钟 500 1600 个颗粒是**逞/span>率。如果样品速率高于这个范围则需要进行稀释、/span>
如果依据这个操作步骤来使 qEV 柱，并且毎/span>个馏分的体积很精确的话，EVs 会始终洗脱于馏分 7? 9，而馏 10 11 中的含量徇/span>少、/span>
操作温度
qEV 柱经过严格的质量控制，流速大 1 毫升/分钟?#177;0.2 毫升/分钟）。对于一些样品来说，操作温度可能会影响流速，*终影 EVs的洗脱峰形、/span>
回收率的优化温度为在 15 C 25 C 之间 ，因此推荐的操作温度 15 - 25 C 、/span>
大体积样品的操作 4
对于一些生物流体来说， qEV 纯化前，可以這/span>过将样品预先浓缩来获得更多的外泌体。根?/span>所使用的样品和其它制备步骤，此操作步骤?/span>以根据需要相应修改、/span>
1）取定量的细胞培养液，将样品离心 1500 g＋/span>10 分钟，随后离 3000 g?0 分钟，取上清液。对于细菌细胞来说，则需要更高的离心力、/span>
2）用 Merck Millipore 离心装置或等同的装置?/span>浓缩细胞培养液。Amicon Ultra 15 是一 50mL Falcon 类型装置，需要很低的离心转速，* 4000 g。这样的话每次离心需 15 分钟。这个装置可以将 15 mL 液体浓缩 300-500 L、/span>
3）如果样品中含有不溶物， qEV 纯化剌/span>10?00 g 离心 10 分钟，去除沉淀。否则这些沉淀会对后续 TRPS 分析造成影响、/span>
4）样品经过以上浓缩便可以按照上面第二部分来进 qEV 纯化了。样品馏分收集见 2 页、/span>
qEV 馏分 TRPS 分析
对于 TRPS 分析来说，Izon Science 推荐使用Izon 试剂盒，这个试剂盒可以用来预涂纳米孔并可以在整个操作过程中使用、/span>
TRPS 的准备阶段和操作阶段中，需要过滣/span>所有试剂以避免污染或者大颗粒 TRPS 浓度测试的干扰。Izon Science 推荐使用当天新配皃/span>过膜?.22 m 注射器式滤器）试剂、/span>
TRPS 分析 qEV 馏分时，Izon Science 推荐尅/span>馏分在初始电解液稀 1/5 1/10。优化稀釉/span>比例，使?*压力下的通过速率为约每分钞/span>500-1600 个颗粒，以避免纳米孔堵塞、/span>
如果对于 TRPS 分析来说囊泡浓度过低，需?/span>浓缩样品（见下面）。下面部分介 qEV 馏分收集后的样品浓缩、/span>
qEV 馏分收集后的样品浓缩
对于小体积样品或对于 EVs 的样品来说，浒/span>缩囊泡可以使分析变得更简单。下面的方法?/span>以在 0.5 - 1 h 之内浓缩收集到的囊泡、/span>
通过 Merck Millipore Microcon-30 装置浓缩小体积样品（需要实验室离心机达 14?00 g 的离心力）。可以将 0.5 mL 样品浓缩至大 200L。可以重复浓缩获得更多的样品（比如馏刅/span>7-9）、/span>
术语?/span>
色谱９/strong>一种样品中成分分离的方法。由固定相和流动相组成，样品的各组分在两相之间分配。固定相可以是固体，固体支持液体或凝胶。固定相可被填充在柱中，伸展为固定层或分布为薄膜。流动相可以是气体或液体、/span>
柱体积：填充材料和空隙体积的体积和（可简称为床体积）、/span>
馏分９/strong>表示从柱上收集的特定体积，对于给定体积数值恒定。也就是说，馏分 7 0.5 毫升是指收集 3.0 毫升臲/span>3.5 毫升中的 0.5 毫升、/span>
脱气９/strong>指将溶液抽真空来“煮”掉多余的溶解气体，如将?/span>瓶抽真空、/span>
流速：载液的体积流量，单位 mL / min、/span>
空隙体积９/strong>柱中固定相的总体积；柱子的其余部分由凝胶材料填充。它表示 SEC 的排除体积、/span>
囊泡馏分９/strong>囊泡出现在的馏分、/span>
回收率：囊泡从柱子流出的量与进入柱子的量的百分比、/span>
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